高效液相(xiàng)色譜儀（HPLC）現已成爲有機(jī)化學分(fēn)析的重要手段之一。同樣，在食品分(fēn)析中，無論是殘留分(fēn)析還(hái)是成分(fēn)分(fēn)析，HPLC也已成爲不可(kě)或缺的分(fēn)析儀器。和其它分(fēn)析儀器一樣，你(nǐ)若想讓HPLC很好地爲你(nǐ)工(gōng)作(zuò)、得(de)到可(kě)靠的數據，首先你(nǐ)要保養好它，使它處于一個良好的待機(jī)狀态，這樣你(nǐ)操作(zuò)它進行分(fēn)析時就(jiù)可(kě)以比較順利地獲得(de)理(lǐ)想的結果。而且良好規範的操作(zuò)習慣可(kě)以延長儀器使用壽命。

大(dà)家在學校(xiào)或接受儀器公司培訓的時候，老師(shī)或工(gōng)程師(shī)會提出很多的操作(zuò)注意事(shì)項。但(dàn)要是總結歸納一下，最重要的有三點：脫氣、過濾和沖洗。本文圍繞這三點進行討(tǎo)論， 給新從(cóng)事(shì)HPLC分(fēn)析的工(gōng)作(zuò)者一點操作(zuò)建議(yì)，希望能對正确的操作(zuò)儀器有一點幫助。更歡迎有經驗的專家介紹使用經驗，提出好建議(yì)。

一.脫氣

流動相(xiàng)脫氣對于避免HPLC系統出問(wèn)題，順利得(de)到一個理(lǐ)想的數據是一個很有效的措施。HPLC系統内是不希望有氣泡存在的。HPLC泵在輸送液體(tǐ)時要産生(shēng)很大(dà)的力量，由于氣體(tǐ)的壓縮比與液體(tǐ)相(xiàng)比大(dà)的多，因而當氣泡存在時，你(nǐ)将觀察到瞬間的流速降低和系統壓力下降。如(rú)果這個氣泡足夠大(dà)，液相(xiàng)泵将不能輸送任何溶劑，而且如(rú)果壓力低于預先設定的壓力低限，泵将停止工(gōng)作(zuò)。有些泵設計(jì)可(kě)以很好地排除氣泡，而也有一些泵設計(jì)當氣泡存在時将停止運轉。當一個氣泡通過輸液泵時，由于系統壓力大(dà)，氣泡通常會溶解在流動相(xiàng)溶液中，随流動相(xiàng)通過柱子。但(dàn)是到達檢測器流通池時系統壓力又恢複到了大(dà)氣壓，因而氣泡可(kě)能在檢測器流通池中又顯現，在色譜圖上會出現不規律的毛刺。爲解決這個問(wèn)題，有些儀器公司設計(jì)一個反壓控制器，這樣可(kě)以在檢測器出口提供足夠的壓力保持氣泡始終溶解在流動相(xiàng)中直到它們流出檢測器。當然，這個壓力不能超過流通池所能承受的壓力極限，否則可(kě)能損壞檢測器。紫外/可(kě)見(jiàn)光(guāng)（UV/VIS）檢測器的液相(xiàng)色譜圖中的噪音毛刺通常是氣泡進入并通過流通池的征兆。有些檢測器對空氣的存在也非常敏感，但(dàn)表現出的征兆與UV/VIS不同，例如(rú)有報導說(shuō)，當使用熒光(guāng)（FL）檢測器時，流動相(xiàng)中溶解氧的存在可(kě)能會使一些化合物失去(qù)熒光(guāng)性。此外，對于利用待測物質在電極表面發生(shēng)氧化還(hái)原反應引起電流變化而進行檢測的電化學（EC）檢測器，對流動相(xiàng)中的溶解氧的存在也非常靈敏。此外，氣泡的存在有時還(hái)會導緻保留時間不重現。所以，必須注意消除流動相(xiàng)中的空氣，并且還(hái)應避免空氣由管路(lù)（如(rú)，PTFE管）滲透進

流動相(xiàng)中。如(rú)果适當地關注在使用之前脫去(qù)流動相(xiàng)中溶解進的空氣，上述這些問(wèn)題均能避免，或把影(yǐng)響降至最低。常用的脫氣方法有如(rú)下幾種：

1.吹氦脫氣法：

利用氦氣在液體(tǐ)中溶解度比空氣低的特性，在0.1MPa 壓力下，以約60mL/min 流速通入流動相(xiàng)儲液容器中10～15min，可(kě)以很有效地從(cóng)流動相(xiàng)中排除溶解的空氣，能排除接近80%的氧氣。采用一個高效分(fēn)布式噴射流裝置，一體(tǐ)積的氦氣可(kě)從(cóng)流動相(xiàng)中将等體(tǐ)積的幾乎全部氣體(tǐ)排除。這意味着1L氦氣通過1L流動相(xiàng)就(jiù)可(kě)完成排氣這個工(gōng)作(zuò)。這種脫氣方法雖然好，但(dàn)我們國(guó)内氦氣價格較高，很少有實驗室采用此方法。

2.加熱(rè)回流法：

此法的脫氣效果較好。在操作(zuò)時要注意冷(lěng)凝塔的冷(lěng)卻效率，否則溶劑會丢失，混合流動相(xiàng)的比例會有變化。

3.抽真空脫氣法：

此法可(kě)使用真空泵，降壓至0.05～0.07MPa 即可(kě)除去(qù)溶解的氣體(tǐ)。但(dàn)是由于真空脫氣會使混合溶劑組成發生(shēng)變化，從(cóng)而影(yǐng)響到實驗的重現性，因此多用于單溶劑體(tǐ)系的簡單分(fēn)析。

4.超聲波脫氣法：

将欲脫氣的流動相(xiàng)置于超聲波清洗器中，用超聲波震蕩10～20min。此法的脫氣效果最差。

5.在線脫氣法：

現在商品的HPLC 儀器，均可(kě)配在線脫氣機(jī)。在線脫氣使用簡單，低故障，有效。建議(yì)購(gòu)買儀器時一定要購(gòu)買，有的公司是作(zuò)爲選購(gòu)件(jiàn)，所以與儀器公司談配置時應與公司确認。

二.過濾

任何顆粒物進入HPLC系統後都(dōu)會在柱子入口端被篩闆擋住，最後的結果是将柱子堵塞，表現出的特征是系統壓力增加并使色譜峰變形。因此，要采取各種預防措施，包括操作(zuò)步驟和商品儀器自(zì)身(shēn)的各種過濾設計(jì)，努力防止或減少顆粒物進入HPLC系統中，從(cóng)而延長儀器和色譜柱的使用壽命，并提高數據的可(kě)靠性。在HPLC系統中，顆粒物的主要來(lái)源有三個途徑：流動相(xiàng)、被測樣品和儀器系統部件(jiàn)的磨損物。

1.流動相(xiàng)

如(rú)果流動相(xiàng)均由高效液相(xiàng)色譜級溶劑組成，流動相(xiàng)沒有必要過濾。這是因爲高效液相(xiàng)色譜級的有機(jī)溶劑，例如(rú)乙腈、甲醇等，在制造的工(gōng)藝過程中都(dōu)已經過了0.2μm微孔濾膜過濾。同樣，無論你(nǐ)是買的HPLC 級的水還(hái)是在實驗室使用超純水淨化系統制備的水，最後一步也是通過0.2μm微孔濾膜，然而，如(rú)果有任何一種緩沖液中加入了固體(tǐ)物，例如(rú)，磷酸鹽，流動相(xiàng)過濾将是必要的一個步驟。雖然緩沖鹽可(kě)能是可(kě)溶解的、高純的，但(dàn)它還(hái)是可(kě)能含有顆粒物質，例如(rú)在蓋試劑瓶的塑料内蓋時，塑料瓶蓋子與瓶口邊緣擠壓就(jiù)會産生(shēng)塑料顆粒。在這種情況下，添加的一種固體(tǐ)物可(kě)能完全溶解了，但(dàn)是少量雜質顆粒存在于流動相(xiàng)中成爲殘渣。流動相(xiàng)通過0.45μm微孔濾膜過濾對于從(cóng)流動相(xiàng)中除去(qù)所有顆粒物是一個有效方法。0.2μm微孔濾膜也可(kě)以用，但(dàn)是它們就(jiù)這個應用而言并不比0.45μm微孔濾膜更有效，而且它的過濾速度會更慢(màn)，特别是當實驗室使用的試劑和水的質量不太好時。建議(yì)實驗室在編寫制定他(tā)們流動相(xiàng)制備标準操作(zuò)程序（SOPs）時規定，可(kě)以借鑒國(guó)際上同類實驗室的規定，即：流動相(xiàng)制備僅采用HPLC級液體(tǐ)時不需要過濾，反之所有流動相(xiàng)組成在使用前必須過濾。在連接儲液瓶和泵的輸液管的末端入口采用下沉式過濾器（常見(jiàn)材質有熔融玻璃砂芯濾闆和微孔金屬的兩種）也是很重要的。這個過濾器的規格爲≥10μm的微孔物質，所以，它不能取代流動相(xiàng)過濾步驟，但(dàn)是它能除去(qù)系統中的塵土(tǔ)并保證儲液瓶、輸液管使用的可(kě)靠性。

2.被測樣品

液相(xiàng)系統中的第二個顆粒物來(lái)源是被測樣品。一些實驗室在将他(tā)們的樣品放(fàng)置在自(zì)動進樣器盤（或手動進樣）以前，所有樣品都(dōu)先通過一個0.45μm針筒式過濾器過濾。這是一個有效除去(qù)被測樣品中顆粒物的方法。但(dàn)是這個過程也有一點需要關注：你(nǐ)使用了針筒式過濾器就(jiù)不可(kě)能100%得(de)到通過過濾器的被測樣品，總會有或多或少的丢失。丢失來(lái)自(zì)這樣幾方面：過濾器濾膜的吸附、過濾器濾出的顆粒物上的吸附、針筒式濾膜過濾器與針筒連接處的滲漏等。如(rú)果有丢失，過濾後液體(tǐ)中被測物的含量或濃度與原基本樣液的含量或濃度還(hái)相(xiàng)同嗎(ma)？這個問(wèn)題一般需要通過實驗确認。确認這步是要增加工(gōng)作(zuò)量和費用的。過濾器的使用是一種消耗，每個過濾器的價格從(cóng)幾元到十幾元。但(dàn)在做食品中殘留物分(fēn)析時，由于基質大(dà)多比較複雜，所以過濾這步已成爲不可(kě)或缺的一步。在實際分(fēn)析工(gōng)作(zuò)中，一般檢測每一組樣品會帶一個外标、一個添加回收或是質控樣品，所以，隻要最終檢測時得(de)到的信噪比能滿足檢出限要求，可(kě)将這步視爲系統誤差而忽略。

3.儀器系統部件(jiàn)的磨損物

最後，在HPLC系統中顆粒物的另一個主要來(lái)源是輸液泵密封墊和進樣閥旋轉軸的磨損。關于輸液泵密封墊的磨損更換有兩種不同建議(yì)。第一種建議(yì)認爲，在一般實驗室中輸液泵密封墊通常使用壽命爲六個月到一年(nián)，因此建議(yì)半年(nián)或一年(nián)更換這些密封墊，實驗室應基于上述觀點制定定期預防性維護計(jì)劃。該觀點認爲：與輸液泵密封墊顆粒堵塞柱子而更換新柱子的費用相(xiàng)比，更換密封墊的費用低些。一些輸液泵有玻璃砂芯或篩網，可(kě)在流路(lù)中濾掉從(cóng)泵密封墊磨損下來(lái)的顆粒物，防止這些顆粒物随流動相(xiàng)流至柱頭。若有這種裝置應查閱輸液泵操作(zuò)手冊，查看(kàn)推薦的這種過濾器清洗或更換的間隔。另一種建議(yì)則認爲，原裝密封墊的密封效果最好，更換以後容易引起流動相(xiàng)滲漏。所以，隻要不漏液就(jiù)不要輕易更換密封墊。兩種說(shuō)法都(dōu)有其道理(lǐ)，具體(tǐ)如(rú)何操作(zuò)，建議(yì)與儀器公司工(gōng)程師(shī)溝通，各公司的儀器還(hái)是有些不同的。自(zì)動進樣器旋轉軸的密封随着使用時間也會磨損，但(dàn)是在我的經驗中，即便是高負荷的運轉旋轉軸密封墊也可(kě)以使用幾年(nián)。如(rú)果你(nǐ)的自(zì)動進樣器系統有計(jì)數進樣閥轉動次數的功能，你(nǐ)可(kě)以設定一個警鈴當預設閥轉動次數已達到時提醒你(nǐ)。曾有一種說(shuō)法，進樣器最多轉動20，000次，這僅僅是進樣10000個；但(dàn)這似乎不是實驗室涉及的常規樣品分(fēn)析使用壽命，它們的實際使用壽命會更長。旋轉軸密封磨損後會滲液，比較明顯的特征是同一樣品多次進樣後，峰面積值差别比較大(dà)（RSD>5%）。當然，輸液泵的密封墊和旋轉軸的密封墊磨損将增加更多研磨物在流動相(xiàng)中，加速對這些部件(jiàn)的損傷。此外，如(rú)果你(nǐ)日(rì)常運行的流動相(xiàng)有緩沖鹽，如(rú)磷酸緩沖鹽，密封墊的磨損會更快(kuài)。無論顆粒物源于何物，實驗時都(dōu)要将其除去(qù)。推薦在HPLC系統中采用一個0.45或0.5μm的在線多孔過濾器，接在自(zì)動進樣器和柱子之間，即使已使用了保護柱。這個在線過濾器将成爲擋闆代替柱頭的濾闆，而且如(rú)采用一個玻璃砂芯濾闆，既便宜，更換又方便（幾分(fēn)鍾就(jiù)可(kě)更換）。若采用在線過濾，HPLC系統檢測每批樣品開始前記錄下壓力值，當壓力上升一定值，例如(rú)，25%或增加500psi，應該更換玻璃砂芯濾闆了，更換以後沖洗幾分(fēn)鍾系統将恢複到原來(lái)的壓力值。

三.沖洗

使HPLC系統良好運行的第三個要點是保持系統的清潔。你(nǐ)需要關注流動相(xiàng)流經該系統的所有地方，對于這些地方經常性的沖洗，将使你(nǐ)的系統保持在“Ready”狀态：

1.流動相(xiàng)儲液瓶

首先要經常清洗流動相(xiàng)儲液瓶，或者每做一批新樣品更換一次流動相(xiàng)。一個髒的儲液瓶将會污染注入的流動相(xiàng)。建議(yì)儲液瓶中緩沖液使用時間不要超過一周，而有機(jī)溶劑使用時間不要超過一個月。也有人(rén)建議(yì)儲液瓶中保持用溶劑充滿，直到更換分(fēn)析方法儲液瓶需更換新溶劑（流動相(xiàng)組成發生(shēng)變化）時，将舊溶劑倒掉更換新溶劑，這樣勝于将溶劑用完，但(dàn)這對于分(fēn)析樣品量少的實驗室而言似乎有些浪費。儀器公司的工(gōng)程師(shī)建議(yì)儲水瓶的水要天天換，每周瓶子還(hái)應該用異丙醇清洗一次。有的實驗室則在水裡(lǐ)加入0.1～1 mM的甲酸抑制微生(shēng)物的生(shēng)長。這些做法看(kàn)起來(lái)有些繁瑣，但(dàn)卻能起到“磨刀不誤砍柴工(gōng)”作(zuò)用。

2.泵

接下來(lái)要沖洗的是泵。千萬不要一分(fēn)析完沖幾分(fēn)鍾後就(jiù)停泵，特别是當流動相(xiàng)中含有難揮發的緩沖液（如(rú)，磷酸鹽）時。如(rú)果儀器不是連續使用，當流動相(xiàng)蒸發時，難揮發物就(jiù)會粘在活塞密封墊的表面，難揮發物将形成固形物沉澱。這是泵密封墊磨損和單向閥滲漏的主要原因之一。所以，無論使用長短(duǎn)，在停泵以前一定要用非緩沖液流動相(xiàng)沖洗泵在半個小時以上，要是流動相(xiàng)中有難揮發緩沖鹽則建議(yì)沖洗的時間應該更長些。

3.自(zì)動進樣器

自(zì)動進樣器也要按規定清洗。現在的儀器多配有自(zì)動進樣器的沖洗液瓶，通常隻要注意及時更換、補充沖洗液即可(kě)。自(zì)動進樣器用的洗滌液也要采用與流動相(xiàng)相(xiàng)同的方式處理(lǐ)，并根據溶劑的有效期和規定，清洗儲液瓶或更換洗滌液。現在的自(zì)動進樣器設置、操作(zuò)都(dōu)很簡單，如(rú)果時間允許（特别是利用夜間運行），每次分(fēn)析完後設置進1、2針純溶劑（如(rú)甲醇、乙腈），也是一個好做法。

4.色譜柱

對柱子的污染是随使用時間而增加。通常表現是：運行走基線時在記錄的色譜圖中基線噪音增加，泵壓也增加。解決這個問(wèn)題的最有效方法就(jiù)是在每一批樣品分(fēn)析結束後或準備卸下柱子時用大(dà)量的流動相(xiàng)沖洗柱子（例如(rú)，甲醇、乙腈和水）。用梯度沖洗效果更好，具體(tǐ)的比例要根據柱子的說(shuō)明書(shū)和性質而定。

5.檢測器

如(rú)果是正常使用，檢測器将依據其性質并按照(zhào)說(shuō)明書(shū)規定進行洗。例如(rú)UV/VIS 檢測器或FL 檢測器，在對柱子和系統進行沖洗時也就(jiù)一同對檢測器流通池中污染物進行了清洗。但(dàn)是蒸發光(guāng)檢測器或質譜儀則需要按照(zhào)說(shuō)明書(shū)進行定期清洗。這些檢測器在使用時會有難揮發污染物沉積，如(rú)質譜儀離(lí)子源的噴針、毛細管、錐孔闆、預四極等部件(jiàn)，因而，需要定期清洗。而且對聯有這些檢測器的系統沖洗時，最好與這些檢測器斷開，以減少對檢測器的污染。總之，實驗室日(rì)常使用的液相(xiàng)色譜儀要是能認真做好這三項工(gōng)作(zuò)——脫氣、過濾和沖洗，你(nǐ)的儀器可(kě)以得(de)到良好的預防性維護，使用時就(jiù)會感到比較順手。當然，在實際操作(zuò)時遇到的問(wèn)題并沒有這麽簡單，但(dàn)這三個良好習慣将是正确操作(zuò)、使用HPLC系統的基礎。